肿瘤的过继性细胞免疫治疗

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肿瘤的过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy , ACI )是通过输注免疫活性细胞、增强肿瘤患者的免疫功能达到抗肿瘤效果的一种免疫治疗方法。以肿瘤细胞为靶细胞,具有直接杀伤肿瘤细胞作用的免疫活性细胞主要包括NK 细胞、杀伤性T 细胞(CTL )和巨噬细胞3 类细胞。

概述

过继性细胞免疫治疗不仅使患者被动接受自身或同种特异性或非特异性肿瘤杀伤细胞,补充体内细胞免疫功能,而且可直接或间接调动患者本身的特异性和非特异性抗肿瘤机制。

过继性细胞免疫治疗是近年肿瘤生物治疗中最活跃的领域之一[20,21]。白20 世纪80 年代初Rosenberg 等首先报道应用IL-2 / LAK 细胞治疗晚期肿瘤获得成效以来,免疫活性细胞过继治疗在世界各国引起极大重视。

目前用于肿瘤过继免疫输注治疗的主要是淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cells , LAK 细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞( tumor infiltrating lymphocytes , TIL )和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells , CIK 细胞)。

淋巴因子激活的杀伤细胞

( l )生物学特性 [21]

LAK 细胞是一种在体外经IL-2 诱导激活的淋巴细胞。其前体细胞为NK 细胞(CD3-、CD16 +、CD56+ )和NKT 细胞及其他具有抗肿瘤活性的不受MHC 限制的T 细胞(CD3 +、CD16-、CD56-)所组成的混合群体。前体细胞存在于人淋巴组织、外周血淋巴细胞、胸腺、脾、淋巴结、骨髓和胸导管淋巴细胞。

LAK 细胞可杀伤NK 细胞抵抗的肿瘤细胞,其杀伤活性不受肿瘤的MHC 限制。LAK 细胞对IL-2 具有依赖性,必须在高浓度IL-2才能诱导,且其杀瘤能力必须由IL-2 维持。LAK 细胞具有广谱抗瘤性,对各种类型的肿瘤细胞都有杀伤作用。一般认为,LAK 细胞能识别的抗原决定簇广泛存在于肿瘤细胞,而新鲜正常组织不具备能被LAK 细胞识别的抗原决定簇。

( 2 )抗肿瘤机制 [21,22]

实验研究证实,LAK 细胞的抗肿瘤作用可分为以下两个阶段。

1 )识别阶段 LAK 细胞表面广泛分布淋巴细胞功能相关抗原-l ( LFA-1 ) ,其配体为细胞黏附分子( ICAM )-1 、2 、3 ,存在于肿瘤细胞表面,LAK 细胞通过LFA-l 与ICAM-1 的结合而参与肿瘤细胞的识别和结合。肿瘤细胞表面存在LFA3 ,通过与LAK 细胞所具有的CD2 表面抗原(LFA-3的受体)的结合介导LAK 细胞对肿瘤细胞的识别。在LAK 细胞表面存在一种特异性的相关抗原LAA 和LAK-1 抗原的表达,而在多种肿瘤细胞膜表面存在共同的抗原决定簇,为一种胰蛋白酶敏感的蛋白分子,可被LAK 细胞选择性识别。

2 )致死性打击阶段 LAK 细胞与肿瘤细胞接触后,在与肿瘤细胞结合处释放细胞毒性颗粒(cytotoxic granules , CG ) ,在Ca2+存在时释放其中的穿孔素(peforin )、丝氨酸酯酶等杀伤介质,直接杀伤肿瘤细胞。穿孔素在Ca2+作用下聚合在肿瘤细胞膜上,形成跨膜通道,导致液体渗透而破坏细胞。还可通过LAK 细胞膜上 的膜淋巴毒素(m-LT)直接将信号传递至肿瘤细胞。此外,LAK 细胞还可通过分泌多种细胞因子如IL-1 、lL-6、TNF-α、IFN-γ等对肿瘤细胞起间接杀伤作用。

( 3 )临床应用

实验和临床研究均证实,LAK 细胞在IL-2 的维持下具有肯定的抗肿瘤作用。目前认为,LAK/IL- 2 疗法对肾细胞癌黑色素瘤、结直肠癌、非霍奇金淋巴瘤等免疫原性强的肿瘤有较显著的疗效,对膀胱癌肝癌头颈部癌和癌性胸、腹腔积液采用局部或区域治疗也取得一定疗效,且毒副作用较轻[20]。

复旦大学肝癌研究所对不能切除的肝癌患者,经肝动脉化疗栓塞后灌注自体LAK 细胞及IL- 2 ,并与单独行肝动脉化疗栓塞的不能切除肝癌患者对照比较。结果表明,经肝动脉化疗栓塞合并LAK/IL-2 灌注治疗的22 例肝癌有效率(CR + PR )为13.6 % ,包括l 例完全缓解和2 例部分缓解,而对照组(单独化疗栓塞)17 例中仅l 例显示部分缓解(有效率5 . 6 % )。治疗组中大多数患者的生活质量改善或稳定。提示经肝动脉化疗栓塞合并LAK/IL-2 灌注治疗原发性肝癌优于单独肝动脉化疗栓塞治疗,更有效的综合治疗方案有待进一步探索[23] 。

LAK/IL-2治疗对肝癌根治性切除术后预防复发有较大的价值,国内外均有报道根治性切除术后经肝动脉化疗+LAK/IL-2 治疗,可明显降低原发性肝癌术后复发率。

第二军医大学附属东方肝胆外科医院肝癌切除术后分组比较单纯手术切除、手术切除+肝动脉/门静脉化疗、手术切除+LAK/IL-2治疗及手术切除+化疗+LAK/IL-2治疗,各组的术后1 年复发率分别为56 . 7 %、40 . 7 %、32 . 3 %及27.3 % , 后两组术后复发率显著低于前两组,提示手术加免疫治疗有助于降低肝癌术后复发率[24]。

日本在一项随机分组研究中,对76 例肝癌患者术后采用自体CD3AK 细胞输注,与74 例单纯手术切除对照。经0 . 2-6 . 7 年(中位4 .4 年)随访,两组分别有45 例( 59 % )和57 例( 77 % )复发,平均复发时间分别为2.8 年和1 . 6 年,无复发生存分别为28 例(37 % )和16 例(22 %) ,表明术后免疫治疗可显著降低复发危险性达41 %[25]。

复旦大学肝癌研究所自1994 年5 月至1998 年6 月采用以LAK/IL-2治疗为基础进行预防肝癌术后复发的探索。57 例病理证实的肝细胞肝癌患者于肝癌根治性切除术满1 个月后,经肝动脉插管或皮下埋置泵回输或经静脉滴注自体LAK 细胞+IL- 2 。LAK 细胞数量每次(l . 0-2 .0)×10^9,累计输注19 次。除4 例非复发死亡、l 例失访外,全组52 例术后1-5 年复发率分别为3 . 8 %、15.4 %、26 . 9 %、28.8 %和34 . 6 %。提示生物治疗的应用有助于预防肝癌切除术后的复发[26]。

LAK/IL-2 治疗可直接杀灭残留的肝癌细胞,又可提高患者的免疫功能,识别和清除肝细胞恶变,阻断肿瘤的发生。单独应用生物治疗其作用有一定限度。为了有效防治术后复发,生物治疗应予多次反复并尽可能局部应用,同时与其他治疗方法综合应用。如何进一步提高生物治疗的作用仍有待深入研究。

( 4 )改进方法

目前LAK/IL-2 疗法尚有许多局限或不足之处。患者自体LAK 前体细胞数量少,扩增能力较低,杀伤能力有限,同时应用大剂量IL-2易引起严重毒副作用,使患者不能耐受治疗。因此,寻找高效、低毒的新型抗肿瘤免疫活性细胞是目前生物治疗的新方向。近年来的研究表明,应用去除单核-巨噬细胞对LAK 细胞抑制作用的黏附性LAK ( A-LAK )细胞[27,28] 及抗CD3 抗体激活的杀伤细胞( CD3AK )[29,30],能高效激活与扩增并长期存活,体内、外实验抗肿瘤活性均显著高于LAK 细胞,且IL- 2 用量少,不良反应少。采用半固体-液体两步法克隆外周血单个核细胞中的LAK 细胞,在较短时间内即可获得大量均一的LAK 细胞。

肿瘤浸润淋巴细胞

( 1 )肿瘤浸润淋巴细胞(TIL )的特征 [31]

TIL 为浸润在肿瘤组织中具有抗肿瘤效应的淋巴细胞,其主要成分是存在于肿瘤间质内的T 细胞(细胞表型CD3+ CD8 +或CD3 +CD4+ )、小部分为MHC 非限制性T 细胞(CD3 + CD56 + )和NK 细胞( CD3+ CD56+ ) ,其共同特点为表达T 细胞受体( TCR ) ,主耍为α、β链,少数为γ、δ 链组成。

复旦大学肝癌研究所从26 例肝癌手术切除标本中分离培养TIL,细胞表型测定表明其多数为成熟的CD3 +T 细胞(86 . 31 %±13 . 08 % ) , CD11a 阳性细胞比例为74 . 54 %±16.93 % ,与LAK 细胞相比(26 . 72 % ± 15 73 % )有显著差异。在体内、外实验中均观察到对SMMC7721 肝癌细胞的抑制作用[32]。

从实体瘤组织分离的TIL 在体外经IL-2激活后可大量扩增,并对自身肿瘤细胞具有很强的特异杀伤活性。TIL 细胞来自肿瘤组织区域,可特异识别自体肿瘤,具有特异MHC 限制的溶肿瘤活性。TIL 对IL-2 的依赖性较小,仅需较少量IL-2 即可发挥明显的抗肿瘤效果。动物实验表明,来源于小鼠肿瘤的TIL在IL-2 的激活下用于治疗肺转移灶,其体内抗肿瘤效应比常规LAK 细胞强50-100 倍[33]。

TIL 治疗肿瘤具有以下优点:① 取自切除的肿瘤组织,不必抽取外周血,对患者(尤其晚期体弱患者)损伤小;② 在体外可长期培养扩增并保持生物活性;③ 抗肿瘤活性和靶细胞特异性高;④ 对IL-2 依赖性小,可减轻IL-2 的毒副作用,患者易于耐受治疗剂量的TIL ;⑤ 与其他细胞因子(IFN 、TNF 、IL-4)或化疗制剂(环磷酰胺等)联合应用可显著提高疗效。TIL 与LAK 细胞抗肿瘤作用的比较见表1[22]。

表1. TIL与LAK 细胞抗肿瘤作用的比较

比较项目 TIL LAK
来源 肿瘤细胞 外周血淋巴细胞或其他淋巴组织
培养时间 > 4 周 3-5 周
靶细胞特异性 选择性杀伤自体肿瘤细胞 非特异性杀伤肿瘤细胞
治疗所需IL-2 较小剂量 大剂量
效应细胞表型 CD3+、CD8+或CD4+ CD3+或CD3-、CD11b+、CD16+、CD56+
抗肿瘤效应 更强

( 2 )临床反用

TIL 疗法对某些实体瘤取得疗效。TIL 细胞过继输注已用于恶性黑色素瘤肾细胞癌、上皮性卵巢癌乳腺癌等实体瘤的治疗。目前报道应用较多、疗效较强的是免疫原性强的恶性黑色素瘤和肾细胞癌。

Rosenberg 总结对86 例黑色素瘤转移患者用自身TIL 加大剂量IL-2进行治疗,其有效率为34 % , 大部分患者的不良反应短暂,表明TIL 对黑色素瘤患者有效[34]。TIL 对肾细胞癌、非小细胞性肺癌有部分疗效[35] 。

Ratto应用TIL 和IL-2 治疗非小细胞性肺癌患者,其3 年生存率和局部复发率较常规治疗明显改善,尤其是III 期患者[36]。

国内亦有报道应用TIL 治疗消化道肿瘤,近期观察部分缓解率较高,不良反应较轻,但对不能手术、肿瘤过大的晚期患者则疗效较差[37]。通过局部途径( 动脉或区域灌注)应用,TIL 似可进一步提高疗效[38]。

( 3 )局限性

TIL 用于治疗人类肿瘤还有以下不足之处:① TIL 的活性取决于肿瘤的类型、大小和坏死程度等,并非所有的肿瘤都被淋巴细胞浸润;② 从产生免疫抑制因子的肿瘤中获得的TIL 在体外可能不增殖;③ 从转移瘤中获得的TIL 在培养中不能扩增;④ TIL 在体外激活和生长的最佳条件(包括细胞因子的联合应用)目前尚不清楚;⑤ 自身肿瘤特异性TIL 在大多数肿瘤中难以得到;⑥ TIL 体外扩增价格昂费,又易污染;⑦ 通过全身途径输注仅小部分TIL 到达肿瘤部位或转移灶;⑧ TIL 体内抗肿瘤机制尚不明确[32] 。

目前可通过以下途径改进疗效:① 针对患者具体情况设计个体化临床应用方案;② 与化疗药物或细胞因子等联合应用;③ 以TIL 作为受体细胞进行基因水平改造,用于肿瘤的基因治疗。

细胞因子诱导的杀伤细胞

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK 细胞)[21]是由抗CD3 单克隆抗体与多种细胞因子(IL-2、IL-lβ 、IFN-γ等)从外周血单个核细胞诱导生成。CIK 细胞是多种细胞的混合体,效应细胞可能是NKT 细胞和CTL 。CIK 细胞能大量扩增,对IL-2的依赖性明显降低,同时具有T 细胞的抗肿瘤活性和NK 细胞的MHC 非限制性杀瘤特性,而抗肿瘤谱较LAK 细胞更广。CIK 细胞是一组CD3+CD56+T 细胞群,其单个核细胞可有不同的来源,包括骨髓、外周血和脐血等,在体外与多种细胞因子和CD3+单克隆抗体共同培养获得。

不同组合的细胞因子可诱导出多种CIK细胞,其中CD3 单克隆抗体和IFN-γ是必要的组分。CD3 单克隆抗体起丝裂原活性作用,可与T 细胞表面的CD3 交联,诱导细胞活化。IFN-γ可诱导IL-1 等细胞因子的合成。其他常用于CIK 细胞培养的细胞因子有IL-2 、PHA 、IL-7 、IL-12 等。通过培养,外周血中微量CD3 +CD56+细胞得到大量扩增。CIK 细胞能溶解多种肿瘤细胞,表现为MHC 非限制性杀伤,其杀伤活性远高于LAK 细胞。

动物实验结果表明,CIK 细胞的抑瘤作用及抗肿瘤转移作用与LAK 细胞相比差异显著,CIK 细胞较强的体内抗肿瘤活性可能与提高荷瘤宿主体内T 细胞活性有关。CIK 细胞目前在临床应用较为广泛,其确切疗效有待于随机对照研究作出科学的评价。

主要参考文献

现代肿瘤学(第三版),30章,肿瘤的生物治疗,汤钊猷主编,复旦大学出版社,ISBN: 9787309080964, 2011年7月1日出版。

《肿瘤学》,郝希山,魏于全主编,人民卫生出版社,2010年8月

其他参考文献

[ 21] 郑大勇,丁雪梅,尤常宣,等.肿瘤的过继性细胞免疫治疗,见罗荣城,韩焕兴主编.肿瘤生物治疗学,北京,人民卫生出版社,2006:157-190

[ 22] 陈国友,LAK 细胞识别、结合及杀伤肿瘤细胞分子机制的研究进展,国外医学,免疫学分册,1994 , 17:123-127

[23]于育红,叶胜龙,汤钊猷,等。肝动脉内IL-2 /LAK 灌注治疗肝癌的初步疗效观察,临床,1995, 2:10-11。

[24] 周伟平,吴孟超,陈汉,等。肝癌切除加免疫化疗对术后复发的影响,中华肿瘤杂志,l995 , 33 : 35-37 .

[26] 叶胜龙,汤钊猷,于育红.等.生物治疗预防原发性肝癌切除术后复发,中国肿瘤生物治疗杂志,1995,4(3) : 240 。

[32] 陈敏,叶胜龙,吴志全,等。原发性肝癌来源的肿瘤浸润淋巴细胞的生物学特性分析,中国临床医学,1999, 6:8-11 。

[37]顺琴龙,尹浩然,林言箴。TIL 治疗消化道肿瘤的临床观察,中国肿瘤生物治疗杂志,1996, 3:65-66.

[38]陆胜,胡烈薇,华祖德、等。TIL不同治疗途径的疗效分析,中国肿瘤生物治疗杂志.1996 , 3 : 127 -129.