肿瘤的基因治疗

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基因治疗(gene therapy )是指将外源功能基因导入患者的细胞内以纠正先天代谢异常,补偿基因缺失或提供新的功能。这一概念基本上可包括所有类型的人类疾病,如遗传病、肿瘤、心血管疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病,通过人体细胞的基因修饰以预防和清除疾患。

肿瘤的基因治疗即是应用基因转移技术将外源基因导入人体,直接修复和纠正肿瘤相关基因的结构和功能缺陷,或间接通过增强宿主的防御机制和杀伤肿瘤能力,从而达到抑制和杀伤肿瘤细胞的治疗目的[58,59,60]。

成功的基因治疗需要两个条件:① 具备将外源目的基因充分有效地导入细胞的方法以达到治疗目的,有些治疗方法需永久基因转导,有些治疗则短暂表达活性可能就足够了;② 导入的基因必须由导入细胞充分表达,有的需高表达,有些则可低表达。随着分子生物学和免疫学等相关学科的发展和交叉渗透,基因治疗的研究发展迅猛,已从实验研究很快过渡到临床试验阶段,其中尤以肿瘤的基因治疗最为热门。

基因转移技术

目的基因的有效转导和表达是基因治疗成功的前提。基因转移的实施途径有两类:一类是体内(in vivo)直接转移,将带有遗传物质的病毒脂质体或裸露DNA 等直接注射到体内。另一类是离体(ex vivo)转移,将治疗对象的细胞取出,体外培养并导入重组基因,而后将此经基因修饰的细胞重新输回体内。离体方法比较经典、安全,效果较易控制,但技术难度大,不易推广。体内方法操作简便,易于推广,但目前方法尚不够成熟,疗效较短,且存在免疫排斥和安全性等问题。

基因转移的方法分为物理、化学和生物3 大类。生物学方法主要指病毒介导的基因转移,而物理和化学方法则为非病毒方法(表1)[58,59,60,61]。

表1. 基因转移技术

分类 导入方法
物理 DNA 直接注射
物理 颗粒轰击(particle bombardment )
物理 电穿孔(electroporation )
物理 显微注射(microinjection )
化学 磷酸钙共沉淀(calcium phosphate precipitation)
化学 脂质体转染(lipofection)
化学 受体介导(receptor mediation )
化学 多聚阳离子介导(polycation mediation )
化学 原生质体融合(potoplast fusion )
生物 反转录病毒载体(retrovirus vector, Rv )
生物 腺病毒载体(adenovirus vector, AdV)
生物 腺相关病毒载体(adeno-associated virus vector , AAV )
生物 单纯疱疹病毒载体(herpes simplex virus vector, HSV )
生物 痘苗病毒载体(vacinia virus vector, VV )
生物 细小病毒载体(Parvovirus, PaV )
生物 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome , YAC )

物理、化学方法携带的目的基因在细胞内易受DNA酶降解,而且不容易稳定地存在于细胞基因组中,但这些方法比较安全。病毒方法的特点是基因转移效率较高,但安全性问题需引起重视。基因转移技术的选择取决于特定基因治疗策略的生物学需求。例如,为使造血干细胞免受全身化疗毒性反应的损伤,采用反转录病毒载体将多药耐药基因l (MDR1 )稳定地整合到干细胞内,通常需要多个细胞周期。而为了使肿瘤患者产生抗肿瘤免疫能力,可能只要在腺病毒之类病毒载体转导下,目的基因的短暂表达即已足够。在通常情况下,病毒能比非病毒方法更高效地将基因导入细胞,故在目前实施的基因治疗方案中,病毒介导的基因转移技术占绝大多数,其中反转录病毒载体的应用最为广泛。在非病毒体内转移的方法中,脂质体介导和受体介导最具发展前景,而裸露DNA 直接注射人易感组织则是非病毒体内转移的独特途径。

(1) 脂质体介导的基因转移 [58,59,62]

脂质体由包被液相的双层磷脂膜构成,具有与细胞膜融合并释放包裹药物进入胞质的能力。将DNA 包裹在脂质体膜内部可与细胞膜融合并被细胞内吞而实施基因转移。此方法体外基因转移效率很高,离体细胞实验可即时表达外源基因。这种方法也适用于活体内基因转移,一般可经静脉注射将脂质体送达肝脏,还可直接注射到皮肤或肌肉。美国学者采用脂质体包埋HLA-B7基因治疗晚期黑色素瘤,部分患者肿瘤消退或缩小。

( 2 )受体介导的基因转移 [58,59,62]

受体介导的基因转移又称配体(ligand )介导的基因转移,利用配体与不同分化细胞相应的表面受体高效地结合并进入肿瘤细胞。受体介导的基因转导复合物由目的基因DNA 、受体靶向蛋白质配体和中介多价阳离子(通常为多聚赖氨酸)组成,利用DNA 与中价阳离子所带电荷不同而互相聚集,同时多价阳离子与配体共价结合,从而构成三物质相连的介导复合物,与细胞表面相应受体结合并将目的基因DNA 导入受体细胞。目前针对不同细胞受体或细胞表面组分,已构建了各种配体与DNA 的靶向复合物。此种方法可在体内导向特异类型的细胞。由于受体介导的基因转移形成的内吞小泡通常被送到溶酶体而被降解,故目的基因的表达较为短暂。通过在靶向复合物中引入复制缺陷的人类腺病毒作为配体,可明显提高体外受体介导的基因转移效率。

( 3 ) DNA直接注射 [58,59,60]

DNA质粒可直接注射入易感组织而获表达,是体内基因转移的独特途径,但骨骼肌是唯一的受体细胞。这是因为肌肉细胞中溶酶体酶的活性很低,DNA 进入细胞后得以存留,而且外源基因将存在于染色体外而无整合。

( 4 )反转录病毒载体 [58,59,60,63,64]

反转录病毒是一类RNA 病毒,含两条RNA ,病毒进入细胞后,其RNA 即在病毒编码的反转录酶作用下反转录为双链DNA ,能整合到细胞基因组中。反转录病毒载体构建时可去除其结构基因(gag, pol, env),代之以外源目的基因,因此由两端长末端重复序列(LTR )、选择基因和目的基因构成,并由辅助细胞包装,形成有感染能力的复制缺陷型反转录病毒载体。

反转录病毒载体是目前基因治疗方案中最为常用的基因转移方法,其优点为构建简单、感染效率高,能稳定地整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白表达。其缺点为病毒滴度较低,导致基因转染效率低;由于补体介导的病毒灭活,其体内活性低,仅能感染分裂期细胞,缺乏靶向性。此外,理论上还存在随机整合带来的安全危险,即产生有复制能力的反转录病毒的可能性,以及由于前病毒随机整合于宿主基因组而诱导插入突变的潜在能力。

( 5 )腺病毒载体 [58-60,63,65]

腺病毒是一种双链DNA 无包膜病毒,其基因组DNA 约有36 kb ,可编码14种蛋白。该病毒具有末端倒置重复序列,在病毒的复制中有重要作用。腺病毒有近50 个血清型,用于构建载体的主要为5 型和2 型。适合于基因转移的腺病毒载体大多缺失El 或E3 区,代之以外源目的基因(可达7 . 5 kb ) ,通过同源重组,产生缺失El 或E3 区域。带有外源基因的腺病毒DNA 片段,在293 辅助细胞分泌的腺病毒蛋白激活下产生包装蛋白,通过反式互补,可形成带外源基因的重组腺病毒。

在肿瘤的基因治疗中,目前应用腺病毒载体进行基因转移成为研究的热点。这是因为腺病毒载体具有以下优点:① 基因治疗所用的腺病毒(AdV5 、AdV2 )对人类安全,无致病、致癌、致畸的危险;② 对靶细胞的感染范围大,感染效率高,对分裂细胞和非分裂复制细胞均可感染;③ 基因转移不仅可通过静脉注射重组病毒的方式,也可通过口服肠道吸收或气管内滴注等方法,易于推广应用;④ 腺病毒DNA 不整合到宿主细胞染色体中;⑤ 易于制备、纯化和浓缩,提高病毒滴度;⑥ 腺病毒载体可插入7.5kb 的外源基因。其最大的缺陷是免疫原性,故降低免疫原性是临床应用的关键。

( 6 )腺相关病毒载体 [58-60,63,66,67]

腺相关病毒(AAV )是一类单链DNA缺陷性病毒,属细小病毒科,是目前世界上最简单、最小的动物病毒,基因组DNA <5kb 。AAV 不能独立存在,只有在辅助病毒(如腺病毒疱疹病毒)存在的条件下才能在感染的宿主细胞中复制、合成包装蛋白,产生新的病毒粒子。AAV 整合在宿主细胞的染色体中,AAV 载体由于其位点特异性整合的特点倍受重视,AAV 中有一种B19 病毒能特异性地整合到宿主19 号染色体上较稳定存在。目前应用的AAV 载体由AAV-2型构建而成,需要辅助病毒(通常是腺病毒或单纯疱疹病毒)参与进行复制,以外源基因取代其结构基因。

AAV 载体的独特优点为:① 安全性高,人类为自然宿主,无致瘤性;② AAV 基因组可在质粒中克隆,载体构建简单;③ AAV 载体可将外源基因定点整合于人类19 号染色体长臂,基因表达稳定;④ AAV颗粒稳定,可通过离心浓缩提高病毒滴度。但AAV 载体感染效率低、外源基因容量小、病毒蛋白对细胞具有毒性等问题有待解决。

( 7 )单纯疱疹病毒载体 [58-60,63,65]

单纯疱疹病毒(HSV )属双链DNA 有包膜的疱疹病毒,目前构建载体用的是HSV-l 型。HSV 载体具有以下优点:① 宿主范围广,可感染非分裂细胞,特别容易感染神经细胞并长期存活;② 病毒滴度高;③ 外源基因容量大,可达30 kb ,可携带较大的或多个外源基因;④ 可在细胞内长期存活并获稳定表达。但HSV 基因转移到细胞中,外源DNA 不整合,病毒对细胞有毒性,危险性大,且其载体系统制备有一定难度,目前尚未用于临床试验。

( 8 )痘苗病毒载体 [58-61,63]

痘苗病毒(VV )是一类双链DNA 有包膜病毒,在细胞质中复制。VV 载体构建简便,重组病毒易于制备,表达效率高,基因组容量大。但VV 病毒载体基因转移表达短暂,易引起免疫排斥。VV 载体已开始进行临床试验,有望用于肿瘤免疫治疗。

受体细胞

受体细胞(recipient cells )是肿瘤基因治疗的靶细胞。目前,大多数基因治疗是离体将目的基因转染受体细胞后再回输入宿主体内,使目的基因在体内表达并发挥抗肿瘤作用。体内直接基因治疗的受体细胞往往是分裂较快的细胞群体(主要是肿瘤细胞),可以通过组织特异性基因治疗以确保目的基因的正确表达。受体细胞可分为生殖细胞和体细胞两大类,目前人类基因治疗的受体仅限于体细胞。[68]

肿瘤基因治疗受体细胞的选择应综合考虑以下几个方面:① 来源于肿瘤发生部位;② 易于从体内取出;③ 易于在体外培养、扩增;④ 易于被目的基因转染并高效表达;⑤ 体内存活时间较长;⑥ 易于体内回输或移植,并稳定表达目的基因。目前,常用于肿瘤基因治疗的受体细胞有淋巴细胞、造血干细胞、成纤维细胞、肝细胞和肿瘤细胞等。

( l )淋巴细胞

淋巴细胞(主要是T 细胞)是体内重要的免疫细胞,对目前常用的几种基因转移方法都具有一定的敏感性。淋巴细胞易于获得并扩增,可有效地被外源基因转导,并可耐受筛选过程的操作,体外转导的淋巴细胞回输体内可继续存活,且有功能。经反转录病毒载体介导的外源基因导入淋巴细胞,对淋巴细胞原有的特性无显著影响,而转基因淋巴细胞则增加了新的功能,因此是较理想的受体细胞。TIL 是人类肿瘤基因治疗首先选用的受体细胞。应用细胞因子(IL-2、TNF )基因转染TIL ,可使其细胞因子分泌量显著提高,并保留其在体内(特别在肿瘤局部)的生长和抗肿瘤能力。LAK 细胞易于制备,局部应用可提高靶向性,亦可作为肿瘤基因治疗合适的受体细胞。

( 2 )造血干细胞

造血干细胞(hematopoietic cell)能分化成各系血细胞,具有移植方便、繁殖能力强等特点,因此是基因治疗较合适的受体细胞。将多药耐药基因l (MDR1 )转入造血干细胞,可以保护肿瘤患者抵抗大剂量化疗所致的造血功能损伤。将细胞因子GM- CSF 转入造血干细胞中,则可促进放化疗后骨髓造血功能的恢复。但骨髓中造血干细胞比例很低(仅占细胞总数的0 . 05 %以下),且对反转录病毒载体的易感性低,因此提高造血干细胞的分离技术和基因转染效率,是其有效应用于肿瘤基因治疗的关键。

( 3 )成纤维细胞

成纤维细胞具有长期自我更新能力,且符合基因治疗受体细胞的几乎所有条件。与淋巴细胞相比,具有以下优点:① 通过活检容易得到原代皮肤成纤维细胞;② 易于在体外培养和扩增;③ 易受外源基因的转染并能较稳定表达;④ 回植体内后仍能稳定表达目的基因;⑤ 回植的成纤维细胞很容易重新取出。以细胞因子基因转染成纤维细胞用于肿瘤基因治疗在实验中取得较好的疗效,具有良好的应用前景。此外,成纤维细胞PA317作为一种病毒包装细胞,已被广泛应用于反转录病毒的包装和扩增。

( 4 )肝细胞

肝细胞存活期长,且在机体的中间代谢过程中发挥重要的作用。许多遗传性疾病和病毒感染均与肝脏有关,而肝癌又是我国发病率高的恶性肿瘤之一。因此,肝细胞作为受体细胞亦为人们所关注。正常肝细胞是终末分化细胞,在体内不再分裂增殖,反转录病毒载体难以将外源基因转染其中。只有当肝脏受损伤或部分切除时,肝细胞才能分裂和再生部分肝组织。此外,肝细胞直接注入体内也不能存活,必须将肝细胞附着在某些支持物上再植入人体。通过肝部分切除诱导肝细胞的分裂增殖,然后在体外对肝细胞进行基因转染后灌注到肝脏并移植入人体才能有效表达。腺病毒载体的构建具有极高的感染效率,为肿瘤基因治疗以肝细胞作为受体细胞开辟了应用前景。

( 5 )肿瘤细胞

在肿瘤的基因治疗中,肿瘤细胞常是外源目的基因直接攻击的对象。目前在以下肿瘤基因治疗方案中,常以肿瘤细胞作为受体细胞:① 引入肿瘤抑制基因;② 特异导入药物敏感基因激活自杀机制;③ 癌基因反义RNA 表达载体抑制癌基因的表达;④ 免疫基因治疗中导入细胞因子等构建肿瘤疫苗。由于肿瘤细胞始终处于旺盛的分裂增殖状态,故对反转录病毒载体敏感并可高效转导。其关键的问题是,离体培养时必须分离排除极易交错生长的成纤维细胞,并构建肿瘤细胞特异性定向高效表达的病毒载体。

基因治疗策略

肿瘤的基因治疗是生物治疗的一个重要组成部分,肿瘤的基因治疗在经历较短时期的试验研究后很快进入临床应用阶段。据统计至2009 年3 月,全球接受基因治疗的临床方案总数达1 537 项,其中993 项(64.6 % )为恶性肿瘤基因治疗方案。目前应用于肿瘤基因治疗的策略依据不同的目的基因概括如表2[58,69-71]。

表2. 肿瘤基因治疗的基本策略

分类 主要作用 基本方法
免疫基因治疗 增强宿主抗肿瘤免疫 细胞因子和(或)HLA基因导入肿瘤细胞或免疫活性细胞
自杀基因治疗 优化药物敏感性 自杀基因原位导入肿瘤细胞激活自杀机制杀伤肿瘤细胞
抑癌基因治疗 恢复和增强抑癌基因功能 野生型抑癌基因导入肿瘤细胞
反义基因治疗 阻断癌基因的表达 反义核酸导入肿瘤细胞
耐药基因治疗 保护机体正常功能 多药耐药基因导入骨髓造血干细胞耐受大剂量化疗,GSF基因导入造血干细胞增强造血系统再生能力

免疫基因治疗

免疫基因治疗是以免疫学原理为基础建立的肿瘤基因治疗方法,为目前肿瘤基因治疗的主要部分,其中又以细胞因子基因治疗最为集中。这是因为大多数细胞因子基因已得到克隆,导入的方法安全可靠,在体内可稳定表达,且其表达水平无需严格控制。

其基本原理包括两个方面:① 细胞因子基因导入免疫活性细胞,增强其抗肿瘤作用,并以免疫活性细胞为受体细胞,将细胞因子基因带入体内靶向部位,使细胞因子局部浓度提高,更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫效应,其本质是以过继性免疫治疗为基础;② 细胞因子基因和主要组织相容性抗原(HLA )及共刺激分子如B7基因导入肿瘤细胞,造成肿瘤微环境中细胞因子的高表达,MHC 等抗原分子表达增加,肿瘤细胞免疫原性增强,可有效激活肿瘤特异性免疫反应,同时可吸引多种免疫细胞大量浸润并激活其功能,其实质是新型瘤苗特异性主动免疫为基础。目前应用于免疫基因治疗的细胞因子有IL-1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、10 、12 , IFN-α、γ,TNF- α及CSF 等。[68,72-75]

T 细胞是免疫基因治疗获得对肿瘤免疫效应的常用受体细胞,特别是MHC-I 类抗原限制的肿瘤特异性杀伤性T 细胞( CD8+)。为达到有效的作用,至少需要2 个信号,首先是CD8+T 细胞受体必须被MHC-I 类-多肽复合物占据;其次,辅助性T 细胞( CD4+ )必须被激活分泌细胞因子并到达CD8+T 细胞。

从患者中获得的肿瘤细胞在培养中生长,利用载体将细胞因子基因转移到培养的肿瘤细胞中。当肿瘤细胞生长及细胞因子表达水平到达一定程度,即可将这些分泌细胞因子的自体肿瘤细胞接种给患者以激发免疫反应。在大多数情况下,肿瘤细胞进入人体前应先行放射,以保证注入人体后这些细胞不再生长。

Wang 等[76]自行构建了分别表达IL-12 (PXX-IL- 12 )、GM-CSF (pXX-GM-CSF )、Neo(pXX-Neo)基因的质粒,在皮下接种BNL 肝癌细胞的小鼠中经尾静脉高压注射,研究小鼠血清IL-12 、GM-CSF 和IFN-γ浓度变化。发现联合基因治疗可以诱导更强的抗肿瘤作用,显示了很高的肝癌特异性杀伤反应(图30-1 , 30-2 )。联合质粒注射所诱导的高水平IL- 12 和低浓度IFN-γ分泌有助于增强IL-12 抗肿瘤作用,减少其不良反应。

葛宁灵等[77] 将IL-2 基因和B7-1 基因转染Hepal-6肝癌细胞,结果体内免疫原性增强,成瘤性明显下降,并可诱导机体产生抗肿瘤特异性细胞毒性T 细胞,能抵抗亲代肿瘤细胞的再次攻击,并对已建立的肿瘤模型有一定的治疗作用(图30-3 , 30-4 )。比较不同基因转染的肿瘤疫苗免疫宿主后对野生Hepal-6细胞攻击产生的免疫保护效应,发现IL-2 和B7-1 基因联合转染的肿瘤疫苗免疫保护作用最强,小鼠生存时间最长,与单基因转染肿瘤疫苗免疫组及对照组肿瘤疫苗免疫组比较有显著性差异(图30-5)。提示IL-2 和B7-l 基因联合转染的肿瘤疫苗免疫小鼠可诱导体内产生了有效的针对Hepal-6 细胞特异性T 细胞免疫。IL-2 和B7-l 基因表达诱导的抗肿瘤免疫细胞是不同的,两者的联合应用则明显增强协同效应,提高抗肿瘤免疫反应。这种联合转基因的肿瘤疫苗有希望成为预防肝癌转移复发的治疗手段。

经IL-2 和B7-l 基因联合转染的肿瘤细胞免疫小鼠后获得的脾细胞导入IL-12 基因再注射到小鼠皮下移植肝癌内,观察抗肿瘤效果显示:IL-2, B7-1 基因联合转染的肿瘤细胞免疫小鼠后获得的脾细胞有可能成为肝癌过继免疫治疗的效应细胞,并能作为携带抗肿瘤细胞因子的载体细胞,提高过继免疫治疗的疗效,也可能减少大剂量应用外源性细胞因子造成的不良反应。同时还提示,肿瘤内直接注射免疫效应细胞可能也是一种有效的肝癌局部治疗方案。该方法将特异性主动免疫治疗、过继性细胞免疫治疗和免疫基因治疗协同应用.为肝癌的生物治疗提供了新思路[78] 。

将肿瘤抗原基因导入DC ,使DC 自身表达相应肿瘤抗原,可延长免疫刺激的作用时间,并有利于抗原进入MHC-I 类抗原呈递途径,诱导产生特异性细胞毒性T 细胞的应答,因而是一种颇有前景的基因工程肿瘤疫苗制备方案。

刘彬彬等[79]的研究表明,MAGE-1 基因修饰的DC 可在体外诱导较强的对SMMC7721 的特异性杀伤,提示其可望作为一种新型的肿瘤疫苗,在肝癌的防治中得到应用。转染外源IL-12 可进一步增强DC 的活性,提高相应肿瘤疫苗的疗效(图30-6)。

以IL-12 基因修饰的DC 肿瘤疫苗可在小鼠体内诱导增强的抗肿瘤免疫,且以酸洗脱肽致敏的DC 亦可在一些免疫原性较弱及抗原不明确的恶性肿瘤中诱导较强的抗肿瘤免疫,是一项可行的肿瘤疫苗制备的替代方案。

刘彬彬等[80]在小鼠H22 肝癌模型中研究了IL-12基因转导及酸洗脱肽致敏的DC 体内诱导抗肝癌免疫的能力,为DC 在肝癌免疫治疗中应用的研究提供了有一定价值的实验资料。

Qiu等[81]以HBsAg基因修饰的DC 疫苗可有效诱导HBsAg 特异性抗肿瘤免疫,其机制与IFN-γ分泌增强有关,并与抗乙型肝炎病毒免疫相结合,有助于预防肝癌的复发转移。由于血清HBV 阳性患者肝癌标本中癌周HBsAg 的表达频率高于癌细胞,在肝内播散灶中HBsAg也有较高的表达频率,提示以HBsAg 为靶抗原的DC 疫苗可能有助于预防肝癌术后的复发与转移。设计合适的DC 肿瘤疫苗方案,包括用某些功能基因强化DC 肿瘤疫苗的功能,将为肝癌的免疫基因治疗开辟新的途径。

自杀基因治疗

肿瘤的自杀基因(suicide gene)治疗是利用转基因的方法将哺乳动物不含有的药物酶基因转入肿瘤细胞内,其表达产物可将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物,影响细胞的DNA 合成,从而引起细胞死亡。由于目前多用反转录病毒腺病毒作为载体,故称为病毒介导的酶解药物前体疗法(virus directed enzyme prodrug treatment , VDEPT),又称药物敏感基因疗法。[58,82-86]

目前常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-tk)基因和胞嘧啶脱氨酶(CD )基因,尤以HSV-tk 基因最为常用。哺乳动物细胞含有tk基因,只能催化脱氧胸苷磷酸化成为脱氧胸苷酸,而HSV-tk基因产物则还可催化核苷类似物无环鸟苷(ACV )和丙氧鸟苷(GCV )等的磷酸化,这种磷酸化的核苷类似物能掺入细胞DNA,干扰细胞分裂时的DNA合成,最终导致细胞死亡。肿瘤细胞导入HSV-tk基因后,表达HSV-TK ,从而获得对GCV 的敏感性而“自杀”,正常组织则不受影响。由于反转录病毒载体只将基因转入分裂细胞,而在脑组织肿瘤区中,唯一的分裂细胞是肿瘤及其供血结构,故反转录病毒载体介导的自杀基因治疗对脑肿瘤特别理想。在动物实验中已证实,将携带HSV-tk 基因的反转录病毒载体直接注入脑肿瘤并以GCV 处理,可产生显著的肿瘤消退。

自杀基因治疗的显著特点是产生旁观者效应( bystander effect )。研究发现,肿瘤的消除并不一定是所有的肿瘤细胞均有自杀基因。在动物实验中观察到,只要10 %-20 %的肿瘤细胞携带HSV-tk基因即可造成肿瘤的完全消退。最近的研究表明,磷酸化的GCV 通过缝隙连接(gap junction)进入邻近周围TK-细胞,并导致其死亡,这种缝隙连接是由连接蛋白(connexin )介导的,具有组织特异性,不同的肿瘤细胞表达水平不同,决定了旁观者效应的强弱不同。另一方面,由于磷酸化GCV 进入TK-细胞,TK+细胞内基因表达产物浓度下降,对GCV的敏感性也降低,杀伤作用减弱,细胞存活时间延长,旁观者效应进一步增强。

肿瘤细胞被自杀基因杀伤后,其残余碎片肽类物质被浸润的巨噬细胞等抗原呈递细胞摄取加工后呈递给CD4 +T 细胞,进而激活和增殖CD8+T 细胞,进一步扩大对肿瘤的杀伤作用,并能杀死远处部位的亲代肿瘤细胞,从而达到彻底消灭肿瘤、保护宿主免受肿瘤复发和转移的长期作用。

胞嘧啶脱氨酶是某些细菌表达的脱氨酶,哺乳动物细胞不含此酶。该酶可将无毒性的药物前体氟胞嘧啶(5-Fc)代谢为对哺乳动物细胞有毒性的化疗药5-Fu 。将CD 基因导入肿瘤细胞,即能在体内选择性地杀伤肿瘤细胞。

抑癌基因治疗

抑癌基因又称肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene ) ,是正常细胞内能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。抑癌基因可因点突变、DNA 片段缺失、移位突变等原因而失活,导致癌基因激活以及细胞持续分裂进而癌变。[58-60,71,87-90]

抑癌基因包括Rb、P53 、p16 、p21 等,具有稳定染色体、调节细胞分化、控制细胞增殖、诱导细胞凋亡等功能。肿瘤的抑癌基因治疗是指借助于基因转移法恢复或添加肿瘤细胞中失活或缺乏的抑癌基因,恢复抑癌基因的功能,从而对肿瘤产生一定的治疗作用或抑制肿瘤的转移。

目前抑癌基因治疗中应用最多的是P53 基因,其与人类肿瘤密切相关,约半数的人类肿瘤包括肝癌胃癌大肠癌食管癌乳腺癌等人类常见肿瘤中均可检测到P53 基因突变。细胞内正常P53 基因的丢失或结构变化导致功能丧失是细胞癌变的重要原因。将正常P53 基因导入肿瘤细胞或拮抗异常P53 基因的表达,恢复其正常功能,即是抑癌基因治疗的基本策略。

主要采用的是基因转染法,即以反转录病毒或腺病毒载体将野生型P53 基因转染肿瘤细胞。已有报道,在动物实验中利用反转录病毒或腺病毒载体携带野生型P53 基因治疗非小细胞肺癌[88] 或人乳腺癌[89] ,肿瘤的生长和成瘤性均显著抑制。细胞因子和抑癌基因共同表达的腺病毒载体用于治疗小鼠乳腺癌,进一步提高了宿主对肿瘤细胞的免疫杀伤能力,增强了抑癌基因治疗的疗效[90]。

反义基因治疗

肿瘤的反义基因治疗(antisense therapy )是指应用反义核酸与细胞内的核酸相互作用,在转录或翻译水平抑制或封闭癌基因的表达,阻断肿瘤细胞的异常信号转导,使癌细胞进入正常分化或引起凋亡。反义核酸可通过人工构建反义RNA 表达载体(利用DNA 重组技术,在适宜的启动子和终止子间反向插入一段靶DNA 于质粒中,构建反向表达载体,转录时合成反义RNA )、利用诱导剂诱生内源性反义核酸以及人工合成反义寡核苷酸3 条途径获得,以人工合成最为常用。[58,91-93]

具体步骤包括:反义寡核苷酸或反义RNA 与单链DNA 或mRNA 结合,干扰转录和翻译;寡核苷酸与双链DNA 结合成三聚体阻断转录;核酶与相应mRNA 特异结合后将mRNA 降解。这些方法在细胞治疗或动物模型都已证实有效。反义寡核苷酸最早应用,且简单易行。寡核苷酸合成技术的发展进一步推动了反义寡核苷酸药物的迅速进展。

肿瘤的反义基因治疗主要应用于抑癌基因的过度表达和点突变癌基因的表达,以及阻断肿瘤细胞内自分泌或旁分泌细胞因子基因的表达。在许多肿瘤细胞株中证实,反义癌基因寡核苷酸能有效地抑制各种癌基因或前癌基因的活性,如c-abl 、c-fos、c-fes、c-kit、c-myb 、c-myc、c-raf、c-src、 和ras等;在肿瘤动物模型中也表明反义寡核苷酸可抑制癌基因的表达和成瘤性。目前,应用反义核酸治疗人的慢性粒细胞白血病、T 细胞白血病、神经胶质瘤膀胱癌骨髓瘤乳腺癌结肠癌淋巴瘤神经母细胞瘤肺癌已取得一定的效果。

但反义基因治疗的临床应用尚需解决以下问题:① 必须明确特定肿瘤恶变所涉及的所有基因表达;② 反义核酸在机体内的特异性靶向转运;③ 反义寡聚物在体内的迅速灭活。抗肿瘤反义寡核苷酸治疗所针对的分子靶点包括与侵袭转移、细胞凋亡、多药耐药、血管形成、细胞内信号转导通路等相关的基因以及端粒酶等。

至今,已经有几种反义寡核苷酸药物进入临床试验。Liao等[94]将反义H-ras寡脱氧核苷酸用于高表达H-ras 蛋白的人肝癌高转移裸鼠模型LCI-D20 ,反义寡核苷酸处理后的LCI-D20 细胞在体外的生长被抑制,细胞进入S 期比例减少,接种于裸鼠后其成瘤性也被抑制,相应的肺转移率亦显著下降。经反义H-ras处理后接种入动物体内的肿瘤组织,其凋亡细胞的比例显著高于对照组。免疫组织化学检测显示,其H-ras蛋白的表达亦受到显著抑制。

在第一代硫代反义寡核苷酸基础上研发的第二代-2 '-MOE 修饰的硫代间隙反义寡核苷酸,既具有耐受核酸酶、激活RNaseH 的作用,又有增强结合靶mRNA 的活性和代谢稳定性,其更为有利的生化、药代动力学特性使之有望成为广泛应用于临床的反义寡核苷酸药物。应用2 ’-MOE 修饰的反义stat3 寡核苷酸特异性抑制人肝癌细胞stat3的表达,从而显著抑制肝癌的生长、侵袭转移和血管生成,并明显延长荷瘤宿主的生存期,提示可用作治疗HCC 的新疗法(图30-8 )[95]。

耐药基因治疗

肿瘤化疗所致的骨髓抑制是影响化疗强度和疗效的主要制约因素之一,将化疗耐药相关的基因如MDR1重组载体导入骨髓造血干细胞,其表达可防止大剂量化疗所致的骨髓抑制。这一方法选择性地保护化疗药物敏感的正常组织如骨髓。当转导耐药基因后,抗癌药物剂量可加大,足以克服耐药机制,杀伤肿瘤细胞。将MDR1基因离体导入骨髓造血干细胞,使骨髓细胞对化疗药物耐药,然后回输患者体内,增加对大剂量化疗药物的耐受性和反应性,以降低化疗所造成的造血系统毒性。

在实验动物中,移植了MDR1 修饰的骨髓小鼠接受通常致死量的紫杉醇时表现为耐药。临床上以MDR1基因修饰的自体骨髓移植已用于紫杉醇治疗晚期卵巢癌患者。但标记研究表明,耐药基因仅转导少量造血细胞,故其成功与否取决于基因转导水平是否足以承受大剂量的化疗。另一方面,应在化疗所致的非造血系统毒性(如肝衰竭)产生前将肿瘤杀灭。[58,96]

病毒-基因治疗

近年发现,利用基因工程技术对病毒的基因结构进行修饰、改造后的某些条件缺陷性病毒(如重组腺病毒),因具有基因缺陷而不能在正常细胞中复制,利用肿瘤细胞中的基因表达异常可使其选择性地在肿瘤细胞中复制,作为基因表达载体携带目的基因后可起到溶瘤病毒治疗和基因治疗双重目的,称为病毒-基因治疗。这一治疗方法通过病毒载体的复制,使治疗基因的表达量大大增加,提高基因治疗的效果,同时由于病毒在肿瘤组织中复制并不断向四周扩散而增加病毒载体的感染效率。其疗效优于单一的病毒治疗或基因治疗,这是基因治疗的一个新的研究方向。[59,97]

Ren等[98]构建了一系列条件复制性腺病毒载体,其主要特征是删除了5 型腺病毒E1区基因,代之以经过结构优化的甲胎蛋白启动子基因,在其上游插入基因调节序列HS4,在其下游插人腺病毒的E1A 基因和治疗基因TRAIL ,这些插入的外源基因的表达由隔离子和甲胎蛋白启动子共同调控。由此构建了具有治疗意义的重组溶瘤腺病毒载体Ad . HS4.AFP . ElA/TRAIL ,利用特异性针对表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞的溶瘤腺病毒载体表达治疗基因TRAIL ,以达到增强治疗原发性肝癌的特异性及有效性的目的。

Ad . HS4 . AFP . E1A/TRAIL 溶瘤病毒具有针对表达甲胎蛋白的原发性肝癌的特异性,在体外细胞及动物体内肿瘤模型中都可以特异性杀伤肿瘤细胞。该项研究探索了利用异源的肿瘤特异性启动子结合隔离子等基因转录调控元件调控溶瘤性腺病毒载体,在靶向组织中特异性复制病毒与表达插入的外源基因,为肿瘤基因治疗探索一种新的手段。

由于现代生物技术的发展和癌症本质认识的深化,促进了肿瘤生物治疗的基础研究与临床应用,特别是近年分子靶向治疗的深入研究,为肿瘤治疗展现了新的前景。生物治疗单独应用的疗效有限,可能对控制和防治肿瘤的播散和转移具有独特的优势,而与手术、放疗、化疗等常规治疗及局部治疗等方法的合理联合应用以及多种生物治疗技术的综合有序应用,有望进一步提高肿瘤生物冶疗的临床疗效[99,100]。

主要参考文献

现代肿瘤学(第三版),30章,肿瘤的生物治疗,汤钊猷主编,复旦大学出版社,ISBN: 9787309080964, 2011年7月1日出版。

《肿瘤学》,郝希山,魏于全主编,人民卫生出版社,2010年8月

其他参考文献

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