人类肿瘤病毒

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可导致人类发生肿瘤的病毒称为人类肿瘤病毒肿瘤所表现出的临床症状多种多样,肿瘤的发生则是一个极其复杂的过程,涉及单独或相互协调引起机体细胞的遗传物质变异或表达异常,包括体内遗传异常或基因缺陷,体外物理性、化学性和生物性因素等。不同的因素在肿瘤发生和发展过程中所起的作用不同,有些是导致肿瘤发生的启动因素,有些则属于促发因素。生物性致肿瘤因素可包括病毒细菌寄生虫等,其中病毒的作用比较肯定。

肿瘤病毒病因学的提出

19 世纪以前,人们普遍认为肿瘤只是一种遗传性疾病,与微生物无关。直至1908 年,丹麦生物学家维赫尔姆• 埃勒曼(Vilnelm Ellermann )和奥勒夫• 班格(Oluf Bang )将患白血病鸡的血液和器官浸出液接种到健康鸡的身上发生了白血病以后,才在人类历史上首次证明动物肿瘤可由病毒引起。其后的众多研究进一步提示动物肿瘤可由病毒引起。

1909 年,美国纽约洛克菲勒研究所的佩顿∙劳斯( Peyton Rous)将患有肉瘤鸡的肿瘤细胞移植到另一些健康鸡身上,发现可使其中有些鸡也发生了肉瘤。他又将除去肿瘤细胞的肿瘤滤液进行移植试验,也获得了同样的结果。因此他提出鸡肉瘤的发生与其滤液中存在的病毒有关。后来,他还发现了几种鸟类肿瘤病毒。劳斯的研究开辟了肿瘤病因学的一个新领域,奠定了肿瘤病毒病因学的实验基础。1966 年12 月,已87 岁高龄的劳斯获得了诺贝尔生理学或医学奖。

1933 年,理查德• 毕肖普(Richard Bishope )发现了第一个DNA 肿瘤病毒即兔乳头瘤病毒。1953 年,路德维克• 格罗斯(Ludwik Gross )等分离到一种能引起多类组织(腮腺、肾、骨、乳腺)发生肿瘤的病毒,称之为多瘤病毒。这种多瘤病毒不仅可引起小鼠和田鼠患肿瘤,还可引起免、海猪、黄鼠狼等动物患肿瘤。1960 年又从猴肾细胞中找到一种猴空泡病毒40 ( SV-40 )。后来将这3 种病毒统归属于乳多空病毒科。这些病毒主要感染鳞状上皮细胞和黏膜组织,引起多种疣和纤维肉瘤等,一般为良性,但少数可转变成癌。

1970 年,美国人巴尔的摩(Baltimore ) 与特明(Temin )对鲁斯肉瘤病毒研究后查明,该病毒的遗传信息是一条RNA ,体内酶系为反转录酶。这个发现证明了致癌性RNA 病毒侵入宿主细胞后,先经反转录酶的作用,将RNA 反转录成与该RNA 互补的DNA ( cDNA ) ,然后再整合到宿主细胞染色体中,使后者转化为癌细胞。他们的研究奠定了肿瘤病毒病因学机制的实验基础,两位癌病毒专家荣获了1975 年诺贝尔生理学或医学奖。

目前,已发现有30 多种动物的某些肿瘤是由病毒引起的,这些病毒接种至动物脑内可诱发出肿瘤。常见的致瘤病毒有腺病毒肉瘤病毒、脱氧核糖核酸病毒、核糖核酸病毒、多瘤病毒及猴空泡病毒等。这些病毒可诱发脑膜瘤松果体瘤肉瘤星形细胞瘤胶质母细胞瘤室管膜瘤脉络丛乳头状瘤髓母细胞瘤等。

有关病毒与人类肿瘤究竟有什么关系,在很长一段时间内无明确结论。近20 年来,流行病学调查和分子生物学的研究表明,两者之间确实存在着密切的关系。1980 年,发现人T 细胞白血病病毒( HTLV )可引起人某些淋巴细胞白血病,使RNA 病毒与人肿瘤病毒病因学的关系获得巨大突破。

1989 年,世界上一些著名的病毒学家和肿瘤学家在智利圣地亚哥举行的“DNA 病毒在人肿瘤中的作用”国际研讨会上,首次确定了至少有3 种病毒与人肿瘤的密切关系。这就是肝炎病毒(HBV 、HCV )与肝细胞肝癌爱泼斯坦-巴尔病毒EB 病毒)与伯基特( Burkitt )淋巴瘤、鼻咽癌,人乳头瘤病毒(HPV )与宫颈癌有直接关联。除HCV 外,均为DNA 病毒。近10 年开展的预防病毒感染可降低肿瘤发生的实验证据进一步证实病毒与人类肿瘤密切相关。

目前比较明确与人类肿瘤密切相关的病毒有4 种DNA病毒和2 种RNA病毒,前者包括EB 病毒、高危型人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒及人疱疹病毒8 型,后者有HTLV 和丙型肝炎病毒。本文将对其中的5 种进行重点介绍。

总结已有的研究结果,现一般认为凡能引起人或动物发生肿瘤或体外能使细胞转化为恶性表型的病毒均可称为致肿瘤病毒。确定为肿瘤病毒则必须符合以下6 条标准:① 先有病毒感染,后发生癌变;② 新分离的肿瘤组织内存在病毒的核酸和蛋白质;③ 体外组织培养中能转化细胞;④ 分类学上同属的病毒可引起动物肿瘤;⑥ 存在流行病学证据;⑥ 用病毒或病毒的组织成分免疫高危动物或人群,其肿瘤发病率下降。

病毒致肿瘤机制概述

人类肿瘤病毒引起人类癌症的机制和动物肿瘤病毒引发动物肿瘤是不同的,前者的感染一般具有长期潜伏和隐蔽的特点,通常与宿主处于“和平共处”状态,对宿主无害。只在偶然情况下,在宿主体内、外因素作用下才激活病毒的致肿瘤性。例如,在激素、代谢产物或辐射等的作用下,这些病毒才引起宿主肿瘤或白血病的发生。

因此,在人肿瘤发生的多基因改变和多阶段的过程中,有些病毒可能是导致肿瘤发生的启动因素,也有些病毒属于促发因素。一般认为,病毒引起肿瘤的机制是它们进入细胞后,主要涉及对宿主细胞遗传信息的改变,包括DNA 突变、染色体异常、对DNA 的后天性修饰和组蛋白的各种修饰等(epigenetics,表观遗传学变化),以及蛋白质与蛋白质间的交互作用。某些病毒,特别是DNA 病毒和反转录病毒在感染中可将基因整合于细胞染色体中,随细胞分裂而传给子代,导致宿主的DNA 发生突变,染色体异常,引起肿瘤。

某些病毒主要通过病毒蛋白与基因蛋白之间的作用对细胞多方面发生多种作用,包括:① 作用于细胞膜,有的病毒基因产物为生长因子或其受体类似物,可不断刺激细胞进行增殖;② 跨膜信号传导,有的病毒基因产物具有类似G 蛋白的作用,虽不能有效地调节信号输入,但可使细胞处于持续信号传入状态;③ 作用于细胞质,有的病毒基因产物本身为蛋白激酶,通过胞质蛋白激酶的磷酸化而影响细胞第二信使的产生;④ 作用于细胞核,正常细胞核内存在核蛋白和核受体,一些病毒基因本身为核蛋白、核受体或转录因子,参与转录及DNA 合成的改变。病毒基因产物作用于细胞多个部位而改变细胞代谢,以致细胞发生癌变,因此称为病毒癌基因多效性作用。

另一方面,人类机体在进化过程中形成了完善的免疫系统,具有抵御和清除因病毒作用而产生的少数癌变细胞的能力,能够消灭肿瘤细胞于萌芽状态。只有当机体免疫力降低或被破坏时,肿瘤病毒使宿主细胞异常增生而发生癌变才成为可能。因此,机体是否能有效免疫监视在肿瘤发生、发展中起了重要作用,结果只有少数人群感染病毒后产生肿瘤,并且一般需要有较长的潜伏期。

HTLV 与成人T 细胞白血病

研究发现,在RNA 肿瘤病毒中,人T 细胞白血病病毒(human T cell leukemia virus,HTLV)与成人T 细胞白血病(adult T cell leukemia , ATL )的发生有病因学上联系[1, 2] 。HTLV 病毒分为l 型和2 型( HTLV-1 、HTLV-2 )。HTLV-1 已公认是ATL 的致病因素,但尚未肯定HTLV-2与人类何种疾病有关。

详见主条目人T 细胞白血病病毒

乙型肝炎病毒与肝细胞肝癌

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma , HCC )是常见的恶性肿瘤,HCC 发病率在男性肿瘤中居第5 位,女性肿瘤中居第8 位,估计每年有5 000-10000 个新增病例。与大部分其他肿瘤的发展过程相似,HCC 的形成是个长期的、逐渐演变的过程,其中包括最终导致肝细胞恶性转化的基因改变。随着越来越多的肿瘤靶基因和基因网络被广泛研究,人们对肿瘤的形成和治疗有了更进一步的认识,乙型肝炎病毒(HBV )感染与HCC 之间的联系日益受到重视。研究表明,超过80 %的HCC 患者都有感染HBV 的病史,在经历数十年的慢性HBV 感染后,有30 % - 40 %的患者进展为肝硬化,而这些肝硬化的患者中每年又有1 % - 5 %随后发展为HCC[18]。流行病学资料表明,慢性HBsAg 携带者患肝癌的危险度比非感染人群高25-37 倍[19]。

详见主条目乙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒与肝细胞肝癌

丙型肝炎病毒(HCV )于1989 年被发现,目前HCV 感染在世界范围都有分布,至少有1 . 7 亿人感染,约占全球人口的3 %。HCV 的传播途径主要有输血传播、母婴传播及性传播等。HCV 的急性感染期可出现流感样症状,但通常无任何表现,80 %左右的急性感染者会导致慢性感染,HCV 的慢性感染最终会导致肝硬化,甚至肝细胞肝癌[36] 。HCV 感染诱导的慢性炎症反应、细胞因子以及肝细胞的再生在肝癌的发病过程中起重要作用。越来越多的证据表明,HCV 可以直接通过影响某些细胞内重要蛋白或通路来促进细胞的恶性转化。因此,HCV 被认为是一种RNA 肿瘤病毒。

详见主条目丙型肝炎病毒

EB病毒与伯基特淋巴瘤、鼻咽癌

1964 年Epstein和Barr 首先从伯基特淋巴瘤培养成功两株淋巴瘤细胞系,在电镜下观察到其形态与病毒相同,血清学及生物学研究证明是一种独特的疱疹病毒,称为爱泼斯坦-巴尔(Epstein - Barr )病毒(EB病毒,EBV )。已知EBV 与伯基特淋巴瘤鼻咽癌霍奇金淋巴瘤传染性单核细胞增多症(IM )等有密切的关系。长期以来,随着人们利用血清学、流行病学、分子生物学等方法对EBV 的深入研究,其与恶性肿瘤的关系日趋受到重视(表3-2)。

详见主条目EB病毒

人乳头瘤病毒与宫颈癌

人乳头瘤病毒(human papilloma virus , HPV )可通过人体间密切接触而传播,导致感染者发生皮肤寻常疣或生殖器尖锐湿疣等疾病。1995 年,国际癌症研究中心(IARC )证实HPV 与宫颈癌密切关联,从而确定HPV 为DNA 肿瘤病毒。

人乳头瘤病毒的生物学特性

HPV 是一类无包膜球状小DNA 病毒,属于乳多空病毒科,可导致人类皮肤与黏膜异常增生,并引起组织疣状病变及乳头状瘤。其环状双链DNA 基因组由7200-8000 bp 构成。目前已鉴定出HPV 有100 多种基因型[59,60]其中有大约40 种可感染生殖道黏膜。根据HPV 基因型与女性生殖道恶性肿瘤发生危险性高低的相关性,HPV 又可分为低危型和高危型。低危型(如HPV-6,11 、41 、42 、43 等)主要引起尖锐湿疣等良性病变;高危型(如HPV-16 、18 、31 )与宫颈癌等肿瘤密切相关,90%以上的宫颈癌与HPV-16 、18 、31 有直接因果关系[61, 62] 。

HPV DNA 基因组虽为环状双链,但只有其中一条DNA 链具有编码功能,包括3 个功能区,即早期转录区、晚期转录区和上游调控区(URR ) [63]。早期转录区约占4kb ,含有6 个开放阅读框,编码El 、E2、E4、E5 、E6、E7 病毒蛋白(图3-8 ) ,具有参与病毒DNA 复制、转录、翻译、调控和细胞转化等功能(表3-3 )。其中E6 、E7 是最有效的病毒癌蛋白,与病毒的细胞转化功能及致癌性有关。E6 蛋白能与细胞内E6 相关蛋白(E6-associated protein , E6AP ) 形成复合物,从而间接与P53 抑癌蛋白结合,使P53 降解失活,导致细胞周期失控。

研究发现,它还可通过激活端粒酶使正常细胞永生化。E7 则可与视网膜母细胞瘤(Rb )抑癌蛋白结合。晚期转录区也称为L 区,由约3000 bp 构成,有两个主要的开放阅读框,分别编码Ll 、L2 病毒蛋白。L1 区编码主要衣壳蛋白,为主要的种特异性抗原;L2区编码次要衣壳蛋白,是型特异性抗原。上游调控区(URR )又称为长控制区(LCR )或非编码区(NCR ) ,由约1 000 bp 构成,位于早期转录区、晚期转录区之间,其功能尚不明确,可能对病毒复制及转录具有调节作用[64]。

表3-3 HPV 基因产物、调控区及其功能

基因 功能
El 病毒DNA 复制
E2 转录调节、病毒DNA 复制
E4 尚不明确,可能参与成熟病毒颗粒释放
E5、E6、E7 细胞转化
L1 主要衣壳蛋白
L2 次要衣壳蛋白
URR 病毒DNA 复制、转录调节

人乳头瘤病毒致宫颈癌的发病机制

自从Harald zur Hausen ( 2008 年诺贝尔生理学或医学奖获得者)首先在宫颈癌中分离出HPV-16 、18 DNA 以来,大量的生物学及流行病学研究确认了HPV 与宫颈癌的直接因果关系。高危型HPV-16 、18 是导致宫颈癌的主要亚型。现已知HPV 引起宫颈癌是一个多步骤的过程,包括:① HPV 侵入细胞及其基因的表达;② HPV 持续性感染的建立;③ HPV 有关基因编码产物与宿主细胞基因产物相互作用;④ 宿主细胞功能紊乱,导致细胞转化。其中病毒癌蛋白E6、E7在HPV 诱发宫颈癌的机制中发挥了关键作用。

Ziegert 等[65]研究发现,HPV DNA 在宿主细胞中以两种方式存在:一种是整合状态;另一种是染色体外的附加体形式。良性或癌前病变中的HPV一般以游离态存在,而在恶性肿瘤中则为整合状态。整合部位常发生在E1-E5 、L2区,这些区域的DNA 片段随整合而丢失,而E6 、E7 则整合于宿主基因组中发挥作用。

其中E6、E7 蛋白的过量表达在宫颈癌变中起关键作用。E6 、E7 蛋白的促转化作用受E2蛋白的调控,E2 蛋白和URR 内的增强子(enhancer )结合,反馈性调节基因转录,HPV DNA 整合进宿主基因组往往引起病毒E2 片段的缺失,导致E6、E7 基因失控而过量表达[66] 。研究发现E6 、E7 可与许多重要细胞蛋白结合,并使其降解,从而影响细胞周期、细胞增殖及凋亡的调控。E6 通过结合泛素蛋白连接酶E6AP进而结合P53 ,从而使P53 泛素化,随之被26S 蛋白酶体降解,导致细胞凋亡抑制以及细胞基因突变蓄积[67]。

近期发现E6 诱导的P53降解还可下调notch l 表达,导致基因组完整性降低[68] 。E6 通过E6AP 还可降解人端粒酶(telomerase )抑制蛋白NFXl-91 ,从而活化端粒酶[69]。高危型HPV E6 蛋白含有PDZ 基序[X-(S / T )-X-(V /L/ I )] ,此基序对于E6 的转化活性与致癌性至关重要,目前发现许多含PDZ 基序的细胞蛋白为E6 靶蛋白。由于含PDZ 基序的细胞蛋白在维持细胞极性、细胞黏附、多蛋白信号复合物支架中发挥作用(图3 -9),所以E6 可能通过这些细胞靶蛋白影响细胞极性,从而导致细胞转化和发生癌症。

图3-9 高危型HPV E6、E7 作用的细胞靶蛋白及其结果

E7 通过与众多细胞靶蛋白结合发挥其癌蛋白功能。E7 蛋白通过钙离子活化的钙蛋白酶(calpain )裂解并灭活抑癌蛋白Rb ,使得正常状态下与Rb 结合的转录因子E2F-1 解离出来,导致细胞周期激酶抑制因子P16INK4a过量表达,从而引起细胞周期失调[70] 。研究还发现E7 可与Rb 结合因子(P600 ) 结合,从而促进细胞转化[71]。另外,E7 与转录辅助激活因子P300 、P300 结合因子(P / CAF )结合,降低其乙酰转移酶活性,导致Rb 乙酰化降低,从而干扰Rb 控制的细胞周期及细胞分化[72]。P / CAF 也是控制P53 转录表达的转录辅助激活因子,因而E7 可能通过P / CAF 间接抑制P53的表达,从而降低P53 功能。E7 结合细胞PP2A 磷酸酶,诱导Akt 活化,也可能促进E7 的转化能力[73]。

基因组失稳定性在许多癌症发生、发展中具有重要作用,研究表明高危型HPV E6 、E7 都能诱导基因组稳定性丧失。E7 通过作用于细胞周期蛋白A 和细胞周期蛋白E/CDK2 ,在相对较短的时间内可诱导中心体过度复制,并伴随有多极性纺锤体孔形成;而E6 的作用发挥较慢,很可能通过失活P53,干扰有丝分裂和(或)有丝分裂后检测点控制,使得在中心体异常的情况下仍然允许细胞进行有丝分裂并完成DNA 复制[74] 。E6 、E7 还可上调参与G2-M 期转换及有丝分裂进程的基因表达,如aurora-A 、plk1、生存素(survivin )和CENP-E[75] 。因此,E6、E7很可能利用多种途径引起细胞基因组稳定性的丧失。

HPV 持续性感染致癌的首要前提是病毒必须有效逃逸宿主免疫防御。研究表明高危型HPV E6 、E7 能有效抑制宿主先天免疫防御。E6 与干扰素调节因子-3 ( interferon regulatory factor-3 , IRF-3 )结合,抑制其反式激活功能。而E7 结合IRF-1 ,从而抑制IFN-β 启动子活性。同时,E6 、E7 也可抑制IFN-α的抗病毒和抗增生活性。

尽管激素在宫颈癌中的作用仍存在争议,但在HPV E6、E7 转基因小鼠中的研究表明,雌激素 可促进HPV 所致宫颈癌的发生[76]。1 / 3 的宫颈癌组织中负责将雄激素转换为雌激素的芳香酶(aromatase ) 表达水平高于癌前或正常宫颈组织,并且在HPV 阳性宫颈癌细胞中外转芳香酶可上调雌激素受体活性,促进细胞增生和锚定非依赖性生长(anchorage - indepent growth )[77] 。另外,E6 、E7可直接与肿瘤抑制蛋白BRCA1 结合,导致BRCA1 抑制雌激素诱导的转录活性减弱[78]。这些结果提示,在HPV E6 、E7 诱发宫颈癌的过程中,雌激素、芳香酶和雌激素应答基因可能也发挥了促进作用。

问题与展望

与确定病毒与动物肿瘤相关已经有百年的历史相比,明确病毒与人类肿瘤密切相关还只是近30 多年的事,主要原因如下。

( l )人类肿瘤从病毒感染到最后发生肿瘤所需要的时间特别长

动物病毒引起肿瘤一般仅需几周或几个月,而人类肿瘤一般要在病毒感染后数年,甚至几十年才能发现,如HPV 感染高峰在20 岁左右,而宫颈癌的发病高峰则在40-50 岁,中间经过了20多年的潜伏演变期。乙型肝炎病毒引起的肝癌也是如此。因此,判定疫苗预防病毒感染后对阻止肿瘤发生的效果比较困难,需要更长的时间。如尽管美国FDA 已批准HPV 4 价预防性疫苗(HPV-6、11 、16 、18 )进入III 期临床试验,并显示对HPV 感染具有70 %的保护率,但对宫颈癌的预防效果还需进一步确认[79]。

( 2 )人类肿瘤病毒本身不足以引起肿瘤的发生

许多动物病毒接种动物后病毒本身即可引起肿瘤,而人肿瘤病毒常需要与其他致肿瘤及促发因子共同作用才能诱发肿瘤,对病毒致人肿瘤的研究进程直接依赖于我们对人体生物学本质及其他致肿瘤及促发因子的认识水平。如尽管HPV 在宫颈癌的发生、发展中发挥了重要作用,但HPV 感染只是宫颈癌发生的必要条件,而非充分条件,HPV 诱导宫颈癌的发生还需要环境和遗传因素的参与。因此,在深入研究HPV 生活周期及致病机制的同时进一步明确环境和遗传因素仍然具有重要意义。

( 3 )许多人肿瘤病毒缺乏理想的动物实验模型

人肿瘤病毒一般均具有严格的宿主范围和组织特异性,体外常难于通过培养的方法获得大量的病毒颗粒,又难于在体内进行病毒感染的致瘤实验。如HCV 被发现的20 多年间,已对其流行病学、分子生物学以及致病方面的特点和机制有了一定的了解,但仍存在很多缺陷。如大量的试验来自于体外,并且多为单个或几个蛋白质,与HCV 的整体感染情况相差很大。研究HCV 最大的障碍是缺乏高效的、稳定的、可靠的细胞模型,动物模型也仅限于黑猩猩等灵长类。迄今,虽然利用一株来自于日本暴发型肝炎患者的病毒株(JFH-1 ,基因型为2a )成功建立了具有完整的HCV 基因组,能在细胞中完成复制周期并释放有感染性病毒颗粒的细胞系统,但复制水平仍较低,并尚未建立相应的动物模型。

近年来,由于科技的发展,人类对自身的认识有了质的飞跃,人类基因组的解密为我们认识病毒致肿瘤的遗传等因素提供了根本性的保证,表观遗传学的快速发展给我们认识病毒致肿瘤的机制提供了新的技术和视角。我们相信随着对病毒和人类研究的不断深入,对病毒致癌机制一定会有一个更清晰的认识,高滴度、传染性病毒细胞和动物模型的建立,将大大促进人类肿瘤病毒的相关研究及防治药物和疫苗的开发。

主要参考文献

现代肿瘤学(第三版),3章,病毒与人类肿瘤,汤钊猷主编,复旦大学出版社,ISBN: 9787309080964, 2011年7月1日出版。